D2半乳糖致腦老化小鼠的物體識別能力障礙研究

摘要】 目的 應用物體識別方法研究 D2半乳糖長期注射致腦老化小鼠模型的學習記憶能力 ,并比
較物體識別方法與 Morris水迷宮方法對該模型測試的靈敏性。方法 C57BL/ 6 小鼠 ,隨機分成正常對照
組、 D2半乳糖低劑量組(50mg/ kg ,sc) 、 D2半乳糖高劑量組(100mg/ kg ,sc) ,連續造模 8 周。以物體識別方法
和 Morris水迷宮方法測試各組動物的學習記憶能力。結果 在物體識別測試中 , D2半乳糖高劑量組分辨
指數(15. 71 ±3. 94)較對照組(45. 89 ±7. 41)減低具有非常顯著性意義 ( P < 0. 001) ,低劑量分辨指數
(24. 69±6. 25)與對照組的差異也存在顯著性意義( P < 0. 05) 。在 Morris水迷宮測試中 ,D2半乳糖高劑量
組動物逃逸潛伏期比對照組延長有顯著性意義( P < 0. 01) ;高劑量組在目標象限空間探索所停留時間與
游泳距離比均較正常對照組減少有顯著性意義( P < 0. 05) 。結論 D2半乳糖可導致小鼠出現顯著的物體
識別能力障礙 ,用物體識別測試方法比 Morris水迷宮方法更靈敏地反映該模型小鼠的學習記憶障礙。
【關鍵詞】 D2半乳糖; 學習記憶; 物體識別; 水迷宮; 腦老化
Impairment of object recognition in aging model induced by D2galactose W EI Hai2f eng , SON G Qiu2jie , A I
Hou2xi , et al . Department of Pharmacology , Xuan2w u Hospi tal of Capi tal Universi ty of Medical Sciences ,
Beijing Key L aboratory f or B rain A ging , Beijing 100053 , China
【Abstract】 Objective To study the object recognition impairment in D2galactose (D2gal) induced aging
model with object recognition test (ORT) , and compare the ORT and Morris water maze (MWM) in testing
learning and memory in this model . Methods C57BL/ 6 mice divided into groups of cont rol , D2gal (50mg/ kg)
and D2gal (100mg/ kg) . Each mouse was t reated with vehicle or D 2gal (s. c. ) once per day for 8 weeks. The
ORT was used to test the object recognition preference and MWM for s patial learning and memory ability. Re2
sults For ORT , D2gal groups of both doses showed significantly less exploration time on new object ( P < 0.
05) ; the discrimination index (DI) of high dose showed very significant lower DI ( P < 0. 001) , and low dose
showed significant lower DI ( P < 0. 05) , compared with cont rol group. During 42day spatial learning and mem2
ory t raining in MWM , high2dose D2gal group showed significant longer escape latency (P < 0. 01) ; in the probe
t rial , mice of high dose group showed significant less time and distance in the target quadrant compared with con2
t rol group. Conclusion Mice of chronic subcutaneous D2gal injection showed serious object recognition impair2
ment , the object recognition test is more sensitive than Morris water maze in reflectin g the learning and memory
impairment in this model .
【Key words】 D2galactose ; Learning and memory ; Object recognition ; Water maze ; Brain aging
物體識別測試(Object Recognition Test)是利用動
物先天對新物體有探索傾向的原理而建立的學習記憶
測試方法。該方法具有讓鼠在自由活動狀態下進行學
習記憶測試的特點 ,能更近似地模擬人類的學習記憶
行為。本研究擬應用物體識別方法研究 D2半乳糖長
期注射致腦老化小鼠模型的學習記憶能力 ,并與水迷
宮行為學測試相比較 ,為促進物體識別測試方法在我
國學術界的應用提供借鑒材料。
材料與方法
一、實驗動物與造模
因 C57BL/ 6 近交系小鼠已被證明有良好物體識
別與空間記憶能力 ,以及隨衰老而記憶力減退規
律[1 ,2 ]
,本實驗選用 C57BL/ 6 小鼠 ,3 月齡 ,雌性 ,體質
量(20 ±2) g ,購于北京大學醫學部動物中心(許可證
號:SCXK(京) 200220001) ,適應性飼養一周后 ,隨機分
成正常對照組、 D2半乳糖低劑量組、 D2半乳糖高劑量
組。小鼠均在無特殊致病原(SPF)級動物室飼養至行
為學測試前。低劑量組每日于背部皮下注射 D2半乳
糖(購自 Sigma 公司 , G5388) 50mg/ kg ,高劑量組每日
皮下注射 D2半乳糖 100mg/ kg ,對照組注射等量生理
鹽水 ,連續 8 周。
二、行為學測試
1. 物體識別試驗:造模 8 周后 ,參考 Ennaceur
等[3 ]
方法進行物體識別試驗 ,裝置主要由一個測試盒
(自制)與 2 套(每套 2 只)測試物體組成 ,測試物體在
實驗前經篩選有近似的小鼠喜好程度。本實驗測試盒
以 45cm×35cm×20 cm 的乳白色硬塑料方盒自制而成。物體 A 套為藍色方形硬塑兒童玩具 ,約 4. 5cm ×
4. 5cm×5 cm ,B 為白色圓柱形塑料盒 ,底面直徑 4cm ,
高7cm ,兩物體均足夠重以防止小鼠推動。測試環境
要求在隔音、避光的場所。在測試盒上方以 60W白光
燈照射使盒內無陰影處。
測試主要分適應期、熟悉期和識別期。第 1 天為
適應期:在上述條件下 ,將鼠放入測試盒的中間 ,盒內
未放任何物體 ,讓其自行適應性活動 10min。第 2 天
為熟悉期:在測試盒中放入 2 個相同的玩具(AA 或
BB) ,距離長軸(45cm)兩側壁 8cm ,將鼠從盒中距物體
等距離處放入。測試者兩手各握 1 只秒表(上海秒表
廠) ,每只秒表對著 1 個動物 ,開始紀錄其在每個物體
上的探索時間(以鼠嘴湊近物體約 2cm 范圍內計時 ,
鼠爬在玩具上玩或者只是在物體附近走則不能計入) ,
以秒表間斷累積計時測定鼠探索每個物體的時間總
和 ,為在第 3 天的計時提供練習。第 3 天為識別測試
期:將另外一套中的一個物體替換前**中的一個玩
具放入盒內(AB 或BA) ,將鼠放在盒中距兩物體等距
離處 10min。每只鼠測試完成后 ,用酒精擦拭物體以
消除鼠停留在物體上的氣味 ,并且按次序輪流調換各
物體在盒內的位置 ,以消除鼠對物體在盒內位置喜好
程度不同而帶來的影響。
為進一步減少兩種物體本身差異對鼠探索時間比
較的影響 ,本實驗以兩位測試者在同一實驗室內用兩
個相同裝置測試每組的一半動物 ,但兩裝置中的物體
相對應鼠的新舊次序相反(如 A 在一測試者為新物體
在另一測試者則為舊物體) 。鼠的物體識別能力以第
3 天探索新舊物體的時間 ,并以探索時間計算分辨指
數(discrimination index ,DI)來評價。分辨指數計算公
式為:DI = (N2F) / (N + F) ×100 % ,式中 N 為在探索
新物體所用的時間 ,F為探索舊物體所用的時間。
2. Morris水迷宮:由 4d 的訓練期和第 5 天的空
間探索試驗組成 ,見參考文獻[5 ]。
結 果
一、 D2半乳糖對 C57 小鼠物體識別能力的影響
D2gal 兩個劑量組動物探索新物體所用的時間較
對照組減少具有顯著性意義( P < 0. 05) (圖 1A) ;高
劑量組分辨指數較對照組減低的差異具有非常顯著性
意義 ( P < 0. 001) ,低劑量與對照組的比較也存在顯
著性意義( P < 0. 05) (圖 1B) 。這些差異顯示 D2gal
致腦老化鼠在50mg/ kg和100mg/ kg兩劑量對新舊物
體的分辨能力均減低 ,有明顯的物體識別記憶障礙
二、 D2半乳糖對 C57 小鼠空間學習記憶能力的影
響
在 4d 的 Morris 水迷宮空間學習記憶訓練中 ,
D2gal高劑量組動物逃逸潛伏期比對照組延長有顯著
性意義( P < 0. 01) ,而 D2gal 低劑量組逃逸潛伏期與
對照組比尚未達到顯著意義( P = 0. 088) (圖 2A) 。
在空間探索試驗中 ,與正常對照組比較 ,高劑量組在目
標象限所停留時間與游泳距離均減少 ,達顯著性意義(
P < 0. 05) ;而低劑量組差異未達顯著性意義
三、統計方法
各組動物在物體識別試驗的新舊物體探索時間、
分辨指數和在水迷宮空間探索中在目標象限所停留時
間與距離比以單因素方差分析結合 Post Hoc2Duncan
法進行組間比較分析;4d Morris水迷宮中的逃逸潛伏
期(從入水到找到站臺的時間)以重復測量的雙因素方
差分析進行比較分析。數據以 x ±s 表示。
結 果
一、 D2半乳糖對 C57 小鼠物體識別能力的影響
D2gal 致腦老化鼠在50mg/ kg和100mg/ kg兩劑量對新舊物
體的分辨能力均減低 ,有明顯的物體識別記憶障礙。二、 D2半乳糖對 C57 小鼠空間學習記憶能力的影
響
在 4d 的 Morris 水迷宮空間學習記憶訓練中
D2gal高劑量組動物逃逸潛伏期比對照組延長有顯著
性意義( P < 0. 01) ,而 D2gal 低劑量組逃逸潛伏期與
對照組比尚未達到顯著意義( P = 0. 088) (圖 2A)
在空間探索試驗中 ,與正常對照組比較 ,高劑量組在目
標象限所停留時間與游泳距離均減少 ,達顯著性意義
P < 0. 05) ;而低劑量組差異未達顯著性意義(圖 2B)
      討 論
本研究發現 D2半乳糖長期皮下注射可導致小鼠
出現顯著的物體識別記憶能力障礙。而且用物體識別
測試方法比 Morris 水迷宮方法更靈敏地反映該模型
小鼠的學習記憶障礙。鼠的物體識別能力與海馬[4 ]
、
基底前腦[5 ]
和嗅周皮層[6 ]
等腦區功能有關 ,受自由基
損傷[4 ]
以及腦內單胺遞質含量[7 ]
等因素影響。Morris
水迷宮測試的空間學習記憶能力與海馬、紋狀體、基底
前腦、小腦等腦功能區域[8 ]
有關。D2半乳糖可造成鼠腦皮層與海馬自由基損傷[9 ]
、腦內單胺遞質含量減
少[10 ]
,可能是導致其物體識別以及空間學習記憶能力
減低的原因。Luparini 等[11 ]
發現在物體識別測試中出現的老
年鼠輕度記憶損害現象在 Morris水迷宮測試中消失 ,
與我們的研究結果類似。造成這兩種學習記憶測試方
法敏感性不同的可能原因有二: ①鼠的精神狀態。在
物體識別測試中 ,鼠始終處于自主活動的狀態 ,是在日
常精神穩定狀態下進行的測試;而在水迷宮中 ,鼠去找
平臺是在害怕沉水的應激下進行 ,應激本身可導致學
習記憶能力下降。②兩種行為測試方法所依賴的腦功
能區域不同。近年來的研究證據表明 ,物體識別與嗅
皮質或嗅周皮質有高度相關 ,如細胞毒性造成大鼠的
嗅皮質損傷只造成物體識別能力損害而空間記憶保
持[5 ]
,而空間學習記憶能力似乎比物體識別記憶更依
賴于海馬功能 ,如海馬 CA3 區域的部分損傷以及后海
馬的神經毒性損傷可導致 Morris 水迷宮空間識別障
礙而無物體識別能力的損傷表現[12 ,13 ]
,D2半乳糖致腦得進一步研究。
我們應用物體識別測試方法的體會主要有: ①在
測試盒內光線要充足 ,不能留有陰暗處或裂縫; ②測試
物體在要實驗前作鼠喜好性篩選 ,并且足夠大以引起
鼠的注意; ③測試者在測試第 2 天需訓練秒表間斷連
續計時法以使第 3 天能熟練計時; ④測試過程中更換
兩物體在測試盒內的位置 ,并只在鼠探索物體時才計
時; ⑤該法測試時間相對長 ,在需測動物數較多時可以
兩人同時進行?？傊?,物體識別測試方法簡便、靈敏 ,
適合學習記憶功能障礙的機理及**學研究。